PCR實驗(experiment)室設計的核心(core)問題是如何避免污染。在實際工作中,常見的有以下幾種污染類型:擴增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染,實驗(experiment)就必須停止,直到找到污染源為止,而且實驗(experiment)結(jié)果必須作廢,需重新進行實驗(experiment)。所以發(fā)生污染后再圍繞(circumfuse)實驗(experiment)室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣(fán suǒ),浪費人力物力。因此要避免污染,首先應是預防,而不是排除(Remove)。
實驗(experiment)室空調(diào)通風系統(tǒng)設計及壓力控制(control)
PCR實驗(experiment)室并沒有嚴格的凈化要求,但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能(maybe)性,宜采用全送全排的氣流組織形式。實驗室凈化由于潔凈實驗室-生物安全實驗室內(nèi)操作對象是危險性的微生物,對人體、動植物或環(huán)境具有危害,必須通過采用合理的空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng),保持潔凈實驗室-生物安全實驗室的相對負壓環(huán)境無論何時都不被破壞,以保證實驗室內(nèi)危險性微生物不能向外部環(huán)境中擴散。同時,要嚴格控制(control)送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。 2.1試劑貯存和準備區(qū)
該實驗(experiment)區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區(qū),不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原料(raw material)必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。 對與氣流壓力的控制(control),本區(qū)并沒有嚴格的要求。
標本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增產(chǎn)物 分析(Analyse)區(qū)
試劑貯存和準備區(qū)
標本制備區(qū)
擴增反應混合物配制和擴增區(qū)
緩 沖 區(qū)
傳遞(transmission)窗
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓,以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。凈化實驗室控制系統(tǒng)是整個潔凈實驗室安全運行的神經(jīng)中樞,由于潔凈實驗室-生物安全實驗室的實驗對象是危險性的微生物,出于嚴格控制污染的原則,它要求以最少的維護人員,運用最優(yōu)化的管理維護手段,來實時監(jiān)控每一個實驗室中設備所處的物理環(huán)境,保證實驗室運行過程中始終處于相對負壓環(huán)境,防止危險性微生物外泄。另外,由于在加樣操作中可能(maybe)會發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。
擴增反應混合物配制和擴增區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為DNA擴增。此外,已制備的DNA模板 (來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內(nèi)進行。
擴增產(chǎn)物分析(Analyse)區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。凈化實驗室必須控制實驗室的潔凈度,對新風進行過濾,使實驗室達到一定的凈化要求。其中排風系統(tǒng)是重點,對于保證實驗室相對負壓環(huán)境和有效過濾室內(nèi)污染排風起著重要的作用。
本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源,因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓,以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。